海藻糖合成酶活性中心的定点突变及其制备海藻酮糖的研究

【摘要】海藻糖合成酶能够以麦芽糖为底物,通过催化分子内转糖基将α,α-1,4-糖苷键转变为α,α-1,1-糖苷键,把麦芽糖转变成海藻糖,可应用于工业化生产海藻糖。提高海藻糖合成酶转化麦芽糖反应中的目标产物的得率并降低副产物的生成,有利于提高底物的利用率从而降低海藻糖的生产成本,因此有必要对海藻糖合成酶的反应特性进行深入的研究。本研究对来自天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、高温弯曲单孢菌(Thermomonosporacurvata)、除虫链霉菌(Streptomycesavermitilis)和灰色链霉菌(Streptomycesgriseussubsp.griseus)在GenBank被注释为海藻糖合成酶基因或假定海藻糖合成酶基因的4个ORF进行克隆和功能鉴定。4个ORF所表达的重组蛋白SCTreS、TCTreS、SATreS和SGTreS都具有催化麦芽糖生成海藻糖的海藻糖合成酶基本特性。利用梯度NativePAGE凝胶电泳进行分子量检测表明,4个重组的海藻糖合成酶在有活性的天然状态下均是同源三聚体。以麦芽糖为底物时,它们的最适pH值都在7.0-7.5,SCTreS和SATreS的最适反应温度都是20。C,SGTreS的最适反应温度为25℃,TCTreS的最适反应温度达到35℃。在最适反应条件下,以麦芽糖为底物时,SGTreS的海藻糖最高得率为87%,生成3.9%的副产物葡萄糖；SCTreS的海藻糖最高得率为76.95%,葡萄糖副产物为6.21%；TCTreS的海藻糖最高得率为70.30%,葡萄糖副产物为8.23%；SATreS的海藻糖最高得率为82.34%,葡萄糖副产物为5.11%。研究分析了SCTreS、TCTreS、SATreS、SGTreS以及来自谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)的海藻糖合成酶CGTreS和来源于极端嗜热菌(ThermusthermophilusHB-8)的海藻糖合成酶GTase的底物特异性,结果表明这6种海藻糖合成酶都能作用于麦芽糖、海藻糖和蔗糖,而对其它纤维二糖、麦芽三糖等11种糖类均不起作用,其中作用于蔗糖能生成海藻酮糖。在最适反应条件下,SCTreS、TCTreS、SATreS、SGTreS、CGTreS和GTase催化麦芽糖的比活力分别为56、65、57、60、55和62(U/mg蛋白),几乎是催化海藻糖(25、35、22、32、26和33)或者蔗糖(10、34、11、28、18和35)时的2倍。利用同源建模与模型结构对TCTreS进行比对分析,推测TCTreS的H120、D217、E259、H328和D3295个位点的氨基酸残基是酶的活性中心关键氨基酸,组成其催化袋结构。对活性中心周围的120个位点氨基酸进行定点突变和酶活力分析,确定35个对酶学特性有明显影响的功能氨基酸残基。影响酶学特性的氨基酸的分布率(FAA)与活性中心的距离的远近呈反相关,距离≤3.5A时,FAA%=62%,3.5-6A之间时,FAA%=33%,在6-10A之间时,FAA%=15%。L116位点定点饱和突变的研究表明,该位点对酶的底物特异性有明显影响,但在麦芽糖和蔗糖底物的变化趋势不一致。19个突变体中L116Y、L116H和L116A对蔗糖的相对活力比野生型提高了2.5倍左右,而对麦芽糖的活性却降低了。E330位点饱和突变的19个突变体对麦芽糖或蔗糖都只有水解活性,分别生成葡萄糖或者果糖和葡萄糖而没有分子内转糖苷活性。V160位点定点饱和突变和突变研究表明,以麦芽糖为底物V160K的海藻糖得率为45%,比野生型V160的70%低。利用ProSa2003软件对TCTreS的E330和V160两个位点的各个突变体进行能量分析,结果发现所有对产物形成有负作用的突变体其局部能量变化均是升高的。能量升高不利于酶本身的稳定,由此推测影响海藻糖合成酶产物得率和副产物形成与酶本身的稳定性有关。把产物得率低和副产物多的CGTreS与其它海藻糖合成酶SCTreS、SGTreS等进行能量分析与比较,发现CGTreS有两个区域能量处于较高水平,对CGTreS这两个区域进行能量最小化突变体构建,其中突变体K279A的海藻糖得率为30%,高于野生酶的25%。基于海藻糖合成酶催化蔗糖生成海藻酮糖和少量的葡萄糖与果糖,而没有异麦芽糖、异麦芽酮糖或者异松三糖等杂糖生成的特点,结合酿酒酵母细胞同化杂糖,首次构建了一种简单、快速和有效的生产、纯化海藻酮糖的新方法,纯化的海藻酮糖经HPLC检测为单峰。
【作者】梁甲元；
【导师】黄日波；
【作者基本信息】广西大学，微生物学，2013，博士
【关键词】海藻糖；海藻糖合成酶；定点突变；活性中心；海藻酮糖；酿酒酵母；

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